計算生命科学の基礎９（望月 敦史）

生命システムの振る舞いを ネットワークの形だけから決定する 望月 敦史 京都大学 医生物学研究所 [email protected]

Research activity of Theoretical Biology Laboratory Plant leaf formation Retinal cone mosaic Somite segmentation Chromosome segregation Circadian Rhythms Biomechanics Mathematical Modeling Reaction Network Network Theories Data Analysis Cell migration Cell diversity Regulatory Network

ネットワークシステムのダイナミクス 0/－/＋ 植物代謝系 構造理論 （1）リンケージロジック ホヤ遺伝子ネットワーク 細胞周期システム 調節ネットワーク →重要な分子 （2）構造感度解析 反応ネットワーク →酵素による調節 （3）構造分岐解析 反応ネットワーク →酵素による変調 がん代謝系 ヒト初期発生遺伝子ネットワーク 中心代謝系 構造と振る舞いを直接結び付ける理論により、生命システムを合理的に理解

遺伝子活性のダイナミクスから、生命機能が生まれる 発現量 影山龍一郎（京都大学ウイルス再生研） 時間 数理モデル 𝑑𝑚 𝑡 =𝑓 𝑝 𝑡−𝑇 − 𝑐𝑚 𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑝 𝑡 = 𝑎𝑚 𝑡 − 𝑇 − 𝑏𝑝 𝑡 𝑑𝑡 𝑘 𝑓 𝑝 = 1 + 𝑝 ⁄𝑝 負のフィードバック 正常胚 イントロン 除去胚 ・重要なパラメータの予測 ・実験的に操作することで検証 →脊椎骨の数の変化や癒合 一つの理想形：「分子の調節関係から、ダイナミクスを理解し、生命機能に迫る」 𝑇 ：時間遅れ

ホヤの細胞分化を司る遺伝子制御ネットワーク 佐藤ゆたか（京都大・理） >90 genes 表皮 脳 神経索 内胚葉 脊索 間充織 筋肉 initial conditions cell-cell interactions Imai, K., et al. Science (2006) 312, 1183-1187.

ホヤ 尾索動物（脊椎動物と近縁）

細胞運命と遺伝子活性 egg 16-cell stage 64-cell stage gastrula tailbud stage 表皮 脳 神経 内胚葉 細胞状態≒遺伝子発現の持続的状態

細胞状態≒ダイナミクスの定常状態 持続的な状態 Cell state 1 Cell state 2 initial states Cell state 3 様々な細胞種が作られる ≒ ダイナミクスの定常状態が多数存在する

遺伝子ネットワークが突きつける問題 表皮 脳 （1）複雑である。大自由度力学系。 神経索 （2）ネットワーク情報は不完全かもしれない。 内胚葉 （3）ダイナミクスは直接観測できない。 （4）関数やパラメータの情報を含まない。 脊索 間充織 筋肉 initial conditions cell-cell interactions Imai, K., et al. Science (2006) 312, 1183-1187.

構造理論 「リンケージロジック」 依存関係だけから振る舞いを決める理論 引数だけに注目 関数形は問わない j i n ネットワーク構造 ⇒ 重要な変数（分子、遺伝子）の決定 Mochizuki, A., Fiedler, B. et al. J. Theor. Biol. (2013) 335, 130-146. Fiedler, B., Mochizuki, A. et al. J. Dyn. Differ. Eqns. (2013) 25, 563-604.

Mathematical Concepts Feedback Vertex Set Determining nodes 取り除いたらループ構造が無くなる ような、ノードの部分集合 全ての解（アトラクター）の観測を 可能とする変数の部分集合 if, and only if, Γ ∖ 𝐼 is cycle free. ⟶ 0 ⇒ 𝐼 ⊆ 𝑉 is a feedback vertex set 𝒙 𝑡 −𝒙 𝑡 𝒙 𝑡 −𝒙 𝑡 ⟶ 0 Theorem Feedback Vertex Set 𝐼 of the network Determining nodes 𝐽 of dynamics on the network for any functions. Fiedler, B., Mochizuki, A. et al. J. Dyn. Differ. Eqns. (2013) 25, 563-604. Mochizuki, A., Fiedler, B. et al. J. Theor. Biol. (2013) 335, 130-146

Feedback vertex set ：それらを取り除くとサイクルがなくなるような頂点の集合 (1) FVSの観測により、システムの全ての解（アトラクター）が捉えられる (2) FVSの操作により、システム全体を任意の解（アトラクター）に収束できる これらは関数の選択に依らない。 Mochizuki, A., Fiedler, B. et al. J. Theor. Biol. (2013) 335, 130-146.

(2) FVSの操作により、システム全体を任意の振る舞いに収束させることができる FVS Theorem target By controlling behaviors of FVS only to converge to a target trajectory, ⟶ ⇒ ⟶ ⇒ : two trajectories of FVS control nonFVS target : two trajectories of whole system spontaneous convergence of the whole system is spontaneously close to converge to the target attractor. Fiedler, B., Mochizuki, A. et al. J. Dyn. Differ. Eqns. (2013) 25, 563-604. Mochizuki, A., Fiedler, B. et al. J. Theor. Biol. (2013) 335, 130-146

(1) FVSの観測により、システム全体のあらゆる振る舞いが捉えられる contrapositive of Theorem FVS the difference is detectable by observing behaviors of FVS only. ⇒ ⇒ ⟶ : two trajectories of FVS : two trajectories of whole system ⇒ ⟶ whole system When two solutions do not converge to the same attractor, Fiedler, B., Mochizuki, A. et al. J. Dyn. Differ. Eqns. (2013) 25, 563-604. Mochizuki, A., Fiedler, B. et al. J. Theor. Biol. (2013) 335, 130-146

直感的に説明 1. 「上」の振る舞いが決まれば、 （セルフループが無い限り）、「下」の振る舞いは一通りに決まる。 2. 振る舞いを決める（観測／制御する）頂点集合を「上手く選んでくれば」、 「残りの頂点の振る舞いが一通りに決まる」ようにできる。 3. 「残りが一通りに決まる」という条件の下で、 振る舞いを決める（観測／操作する）頂点を最少にするには？ ⇒ Feedback Vertex Set!

Controlling a dynamical system - A mathematical model for mammalian circadian rhythms - 7 FVs among 21 variables Modified from Mirsky et al., 2009 4 solutions 2 stable oscillations （P1、P2） 1 unstable oscillation （UP） 1 unstable stationary point （USS）

Controlling a dynamical system - 7 FVs among 21 variables P1→P2 PER2 CRY2 CRY1 7 in FVS ＜＝ prescribe Whole system can be controlled by controlling FVS. ........ Cry1 Per2 Per1 Other 14 ＜＝ ODE ........ (1) Prepare time series of FVS on the solution, P1, P2, UP, USS. (2-1) Prescribe FVS, to follow the value on the solution. (2-2) The remaining variables, nonFVS, are calculated by remaining ODEs.

Controlling a dynamical system Whole system can be controlled by controlling FVS. P1→P2 P2→P1 - 7 FVs among 21 variables P1→UP P1→USS FVS ＜＝ prescribe Others ＜＝ ODE UP, USS; unstable in original system with 21 variable, but globally stable in reduced system with 14 variables.

Structural Theory (1): Linkage Logic Structure ⇔ Dynamics Feedback vertex set (ネットワークの構造から決まる) (1) システム全体の挙動を捉えるために十分な 関数に依存しない最小の変数集合 (2) システム全体を操作するために十分な 関数に依存しない最小の変数集合 Fiedler, B., Mochizuki, A. et al. J. Dyn. Differ. Eqns. (2013) 25, 563-604. Mochizuki, A., Fiedler, B. et al. J. Theor. Biol. (2013) 335, 130-146 Kobayashi, Maeda, Tokuoka, Mochizuki, Satou. (2018) iScience 4, 281–293.

ホヤの遺伝子ネットワーク解析 Version 2015 >90 genes 表皮 FVS 因子 脳 神経索 5つの因子 それぞれの細胞から4因子 Zic-r.b Erk Foxd Twist-r.a Foxa.a Nodal Snail 隣接するいずれかの 細胞から1因子 Neurog Delta-r.b 内胚葉 脊索 間充織 筋肉 Thm： FVSを制御することで、システム全体のダイナミクスが制御できる. ・5つの分子の活性を操作することで、細胞運命を操作できるか？

多核1細胞胚実験系 まずは、 細胞間相互作用や空間構造の効果を除いて 考えたい。 Cytochalasin B syncytium cell divisions are blocked nuclear divisions and gene regulatory networks are not blocked 一部の運命（表皮、脳、神経）しか現れず、かつ胚によってバラバラ（一意に定まらない）

多核1細胞胚実験系を用いたFVS因子の操作 Foxa.a MO（モルフォリノアンチセンスオリゴ）+ Foxd MO + Neurog MO + Zic-r.b mRNA を顕微注入 + bFGF処理（Erkシグナル経路の亢進） 受精後9.5時間まで培養 卵 RT-qPCRによる 細胞ごとの 組織マーカーの 発現解析 多核 1細胞胚 サイトカラシンB（アクチン重合阻害剤）処理 細胞ごとの計測値 ↓ Foxd ↓ 平均 Foxa.a Neurog 脳 筋肉 ↓ ↑ Erkシグナル経路 ↑ Zic-r.b 表皮 間充織 神経系 内胚葉 脊索 間充織 マーカーが 特異的に 発現した

25=32通りのFVS操作胚におけるマーカー遺伝子発現 RT-qPCR それぞれのFVS操作胚においてプレドミナントに発現しているマーカー遺伝子 Foxa.a Foxd Down Down Up Down Down Down Up Down Down Down Up Up Up Down Down Down Down Down Down Up Down Down Down Up Down Down Up Down Down Up Up Down Neurog Zic-r.b Erkシグナル経路 マーカー発現 Foxa.a Down Down Down Down Up Down Down Down Up Down Down Up Down Up Down Up Down Down Down Down Down Up Down Down Down Up Down Down Up Down Up Up Down Up Down Down Down Down Up Up Up Up Down Down Down Down Down Down 表皮 なし 内胚葉 脊索 神経系 脳 なし なし 神経系 間充織 脊索 神経系 神経系 なし なし 脳 Up Up Up Down Down Down Up Up Up Down Up Up Up Down Up Up Foxd Neurog Zic-r.b Erkシグナル経路 マーカー発現 Up Down Down Up Up Down Up Up Down Up Up Up Down Up Up Up Down Up Down Up Down Up Up Down Up Up Up Down Up Up Up Up Down Down Up Down Up Up Down Up Up Up Down Up Up Up Up Up Up Up Up Up Up Up Down Down Down Down Up Up Up Up Down Up なし 神経系 神経系 神経系 なし 神経系 脊索 内胚葉 神経系 内胚葉 脊索 内胚葉 脳 なし なし なし in situ hybridization n=10, 0% 表皮 n=10, 0% 脳 n=10, 0% 神経系 n=10, 0% 内胚葉 n=10, 0% 脊索 n=33, 76% 間充織 n=10, 0% 筋肉 筋肉を除いて、すべての細胞種が理論通りに FVS因子の操作で再現された。 Kobayashi, Maeda, Tokuoka, Mochizuki, Satou. (2018) iScience 4, 281–293.

まとめ ？ ホヤ遺伝子ネットワーク ⇒５つのFVS因子 Foxa.a, Foxd, Neurog, Zic-r.b, Erk ネットワーク全体のコントロールには、 この５つの操作で十分のはず。 実際に５因子の操作で、 ７種の組織のうち、６種が誘導できた。 「期待された7種の細胞のうち、 6種（筋肉以外）しか誘導できなかった」 とも言える。 ⇒何か欠けている情報があるのでは？

つづき ネットワーク解析（その２） 「未知の制御」の候補 付加することでFVSが変わるエッジ Foxc → Admp Foxc → Otx Foxc → Lhx3/4 Foxc → Bmp3 Foxc → Prdm1-r.a Foxc → Dlx.b Foxc → Dmrt.a Foxc → Wnttun5 Admp → Lhx3/4 Admp → Bmp3 Admp → Prdm1-r.a Otx → Admp Otx → Lhx3/4 Otx → Bmp3 Otx → Prdm1-r.a Otx → Wnttun5 Msx → Prdm1-r.a 操作実験 26通りの網羅実験は難しいため、 以下の操作をまず行った。 Foxa.a ↓, Foxd ↓, Neurog ↓, Zic-r.b ↓, Erk ↓, Tbx6-r.b ↑ Efna.d → Prdm1-r.a Efna.d → Prdm1-r.b RT-qPCR Hand-r → Prdm1-r.a 表皮 Mrf → Tbx6-r.b n=24, 平均 脳 筋肉 Prdm1-r.b → Prdm1-r.a 神経系 実験により発見された新たな制御 間充織 脊索 内胚葉 Zic-r.a in situ hybridization Tbx6-r.b Zic-r.b n=11, 0% Mrf 表皮 n=11, 0% 脳 n=11, 0% Otp Meox ６つのFVS因子 Foxa.a, Foxd, Neurog, Zic-r.b, Erk, Tbx6-r.b 脊索 n=11, 0% n=11, 0% 神経系 内胚葉 n=11, 0% n=11, 91% 間充織 筋肉 筋肉が誘導できた‼

ホヤ遺伝子ネットワークの操作 (1) ネットワーク構造 ⇒ FVSの決定 (2) FVS因子の活性操作 mRNA or 阻害剤 表皮 脳 培養 神経索 マーカー発現 組織種の判定 受精卵 筋肉 脊索 間充織 内胚葉 Foxa.a Foxd Down Up Down Down Down Down Down Down Down Up Down Down Down Down Neurog Zic-r.b Down Down Down Up Down Down Down Down Down Down Down Up Up Down Erk Signal Tbx6 Down Down Down Down Down Up Down Down Down Down Down Down Down Up Marker Expression epidermis endoderm notochord nerve cord brain mesenchyme Muscle ・完全操作！ ・理論解析により、ネットワーク情報の更新 Kobayashi, Maeda, Tokuoka, Mochizuki, Satou. (2018) iScience 4, 281–293. Kobayashi, Maeda, Tokuoka, Mochizuki, Satou. (2021) Sci. Rep. 11, 4001.

網羅的な1細胞・１遺伝子スクリーニングによる ヒト初期胚の遺伝子ネットワークの推定 ・CRISPRスクリーニングにより、ヒトiPS細胞に対し、 網羅的な1細胞・１遺伝子摂動実験を行う。 ・時系列に沿ったscRNA-seqデータを取得する。 ・摂動後の時系列から因果関係を推定する新しい方法の開発。

遺伝子制御ネットワーク推定法 多変量解析に基づく手法 ⇒相関関係は得やすいが、因果関係（制御関係）の検出は困難 網羅的摂動と発現変化の計測 ・Perturb-Seq（MIMOSCA (Dixit et al., 2016) ） ⇒全遺伝子を摂動しなければいけない ⇒直接制御と間接効果を区別できない X A B C D 新規推定手法：RENGE(仮) ⇒摂動していない遺伝子からの制御の推定 ⇒直接制御と間接効果の区別

新規ネットワーク推定法: RENGE -REgulatory Network inference using GEne perturbation data石川雅人（東大新領域） A C B CRISPRシステム を用いた網羅的1 細胞1遺伝子摂動 モデル式 𝐸 = 𝑤 𝑠, 𝑘 𝐴 𝑋 + 𝑏𝑎𝑠𝑒 1次制御 2次制御 3次制御 発現 𝑒 , = 𝑤 𝑠, 1 𝑎 ← + 𝑤 𝑠, 2 𝑎 ← + 𝑤 𝑠, 3 𝑎 ← 𝑤 𝑠, 𝑘 : サンプル𝑠における𝑘 次制御の効果の大きさ 1 𝑤 𝑠, 𝑘 = 1+𝑒 培養 培養 培養 摂動 + ⋯ 𝑥 , + 𝑏𝑎𝑠𝑒 （高次の制御ほど弱く現れ、 後のサンプルほど高次の制御まで現れる） scRNA-seqによる 網羅的発現解析 サンプル1 サンプル2 サンプル3 𝐸 𝑋 𝐸 𝑋 𝐸 𝑋 𝑒 , : サンプル𝑠において、細胞𝑐 での遺伝子𝑖 の発現 𝑥 , : サンプル𝑠において、細胞𝑐 で摂動された遺伝子𝑗 発現行列と摂動行列から、 制御行列 𝐴 および 𝛼 、 𝛽 、 𝛾 、と 𝑏𝑎𝑠𝑒 を推定。 制御行列 𝐴 = 𝑎 ← は、遺伝子 𝑗 から遺伝子 𝑖 への直接の制御。 データに含まれる2次、3次…の影響は、𝐴 、 𝐴 …で捉える。 直接制御と間接効果の区別が可能 摂動していない遺伝子からの制御も推定可能

網羅的な1細胞・１遺伝子スクリーニング ・CRISPRスクリーニングにより、ヒトiPS細胞に対し、 網羅的な1細胞・１遺伝子摂動実験を行う。 永樂元次教授（医生研） 遊佐宏介教授（医生研） との共同研究 ・時系列に沿ったscRNA-seqデータを取得する。 A B 23 knocked-out genes ETS2, ETV4, FOXH1, ID1, JARID2, LIN28A, MYC, MYCN, NANOG, NR5A2, PDLIM1, POU5F1, PRDM14, RUNX1T1, SOX2, TRIM24, TRIM25, VENTX, ZIC2, ZIC3, ZNF398, ZNF649, ZNF90 C CRISPRシステム を用いた網羅的1 細胞1遺伝子摂動 2日目 4日目 3日目 5日目 ヒトiPS細胞 未分化維持条件下 培養 scRNA-seqによる 網羅的発現解析 培養 培養 培養

推定されたネットワーク（ヒト初期発生） 各制御（矢印）に、制御の大きさ（係数 𝑎 ← ）と有意度（P値）が与えられる P値<0.05, 係数上位95% ノード（遺伝子）数：91 エッジ（制御）数：372

ヒト初期（三胚葉）分化ネットワーク (1) ネットワーク構造 ⇒ FVSの決定 (2) FVS因子の活性操作 ？ 外肺葉 ？ 中胚葉 ？ 内肺葉

Structural Theories 構造理論 Linkage Logic 制御ネットワーク ネットワーク構造 -> 重要な分子 Structural Sensitivity analysis 化学反応ネットワーク ネットワーク構造 -> 摂動に対する応答 Structural Bifurcation Analysis Network information Experiment ・Network analysis ・Measuring ・Perturbation Prediction without assuming details 化学反応ネットワーク ネットワーク構造 -> 分岐の定性的性質 現在の生物学では、生体分子の相互作用（ネットワーク）情報が多く得られる。 一方でダイナミクスを決定するために必要な定量的情報は未だ限られている。 ネットワーク構造だけからダイナミクスを議論できる理論は、強力で有益なはず。

Chemical Reaction Network Ex. Carbon metabolism - Glycolysis - TCA cycle … produces energy from glucose. ・The network is a summary of knowledge of reactions and catalyzing enzymes. ・Dynamics is not understood yet. ・The network may be incomplete.

Perturbation experiments Knock out each of enzymes, Observe changes in concentration pyk measure measure Yellow: no change, Red: increase, Blue: decrease However, the responses are considered to be difficult to understand. -Many metabolites do not change. -Some changes are “counter-intuitive”. Ishii et al. Science (2007)

Chemical reaction : 物質濃度 𝑗 : 反応速度 𝑗 : 反応パラメータ 𝑚 e.g. Hill function 𝑢 𝑑 𝑢 𝑑𝑡 𝑢 1 −1 1 0 0 = 0 1 −1 −1 0 0 0 0 1 −1 𝑑𝑢 = 𝑑𝑡 𝜈 𝑟 𝑘 ;𝒖 𝑟 𝑟 𝑟 𝑟 𝑟 𝜈= 𝜈 𝑘𝑗 : 酵素活性or量 （反応速度に影響を与える あらゆるパラメータ） ：化学量論行列

構造感度解析 反応ネットワークの形だけからモデルを仮定せず、パラメータ（酵素）変化に対する応答を決定 酵素活性𝑘 ∗ の変化 𝑘 ∗ → 𝑘 ∗ + 𝛿𝑘 ∗ の前と後で定常だとみなす。 ν𝜹𝒓 = 𝟎 𝜹𝒓 = ex. 𝑟 𝑢 𝑟 𝑟 𝑟 ⋯ 𝑟 −𝑐 ⋮ ⋮ 𝑟 −𝑐 ⋯ ⋯ −𝑐 ⋮ −𝑐 𝛿 𝑢 ⋮ 𝛿 𝑢 ⋯ 𝛿 𝜇 ⋮ 𝛿 𝜇 ⋯ ⋯ ⋯ 𝑗, 𝑗 ∗ = 1, ⋯ , 𝐽 𝛿 ∗𝜇 𝑐 𝛿𝑢 ⋮ 𝛿𝑢 𝛿𝜇 ⋮ 𝛿𝜇 𝜕𝑟 𝛿𝑘 𝜕𝑘 =− 𝐴= 0 𝑟 0 0 𝑟 0 0 0 𝑟 0 0 0 0 0 0 𝑟 0 0 0 0 0 0 0 𝑟 A行列の非零成分の分布 ＝ネットワーク構造 0 𝛿 ∗𝑢 𝜕𝑟 𝛿𝑘 𝜕𝑘 diagonal 感度行列S what we need −1 0 −1 1 −1 1 −1 0 0 −1 0 −1 𝑟 ⋱ 0 (1) Construct A-matrix 𝑟 𝑢 ⋯ A行列 given from network 𝑟 𝑢 𝜕𝑟 𝜕𝑢 𝛿𝑘 ∗ = 𝜕𝑢 𝜕𝑘 ∗ 𝛿𝜇 𝒄 𝑟 ⋮ 𝑟 𝑢 𝜕𝑟 𝛿𝑘 ∗ + 𝜕𝑘 ∗ 𝜕𝑟 𝜕𝑢 𝜕𝑢 ≔ 𝛿𝑘 ∗ 𝜕𝑘 ∗ ≔ 𝑟 = 0：反応 j は分子m に非依存 𝑟 ≠ 0 ：反応 j は分子m に依存 (2) Calculate inverse of A 𝑟 S ∝ −A = +𝑟 𝑟 𝑟 𝑟 +𝑟 𝑟 𝑟 𝑟 𝑟 +𝑟 1 𝑟 𝑟 +𝑟 − 𝑟 +𝑟 𝑟 𝑟 𝑟 +𝑟 0 −𝑟 𝑟 𝑟 +𝑟 0 −𝑟 𝑟 +𝑟 0 −1 𝑟 0 0 0 0 0 0 −𝑟 0 0 𝑟 − 𝑟 +𝑟 −𝑟 𝑟 𝑟 +𝑟 0 𝑟 𝑟 𝑟 +𝑟 0 𝑟 𝑟 +𝑟 0 0 0 −1 𝑟 0 0 応答の零、非零（や正、負）がネットワーク構造から決まる Mochizuki & Fiedler J. Theor. Biol. (2015); Okada & Mochizuki Phys. Rev. Lett. (2016)

Example 1 𝑢 : concentration 𝑟 : reaction rate Simulation (by giving a function) Analysis 𝐴= 0 𝑟 0 0 0 0 𝑟 0 0 0 0 𝑟 −1 −1 −1 −1 ⇒ 𝑆= 1⁄𝑟 1⁄𝑟 1⁄𝑟 1 − 1 ⁄𝑟 0 0 0 0 − 1 ⁄𝑟 0 0 0 0 − 1 ⁄𝑟 0 decrease in substrate only time t

Example 2 Increase in direct downward 𝐴= 0 𝑟 0 0 0 0 0 0 𝑟 0 0 0 0 0 0 𝑟 0 𝑟 0 0 0 0 𝑟 0 −1 0 −1 −1 −1 −1 0 −1 0 −1 −1 0 ⇒ 𝑆= 𝑟 + 𝑟 ⁄𝑟 𝑟 𝑟 + 𝑟 ⁄𝑟 𝑟 1⁄𝑟 𝑟 ⁄𝑟 𝑟 1 𝑟 ⁄𝑟 Decrease in side branch − 1 ⁄𝑟 0 0 0 0 0 0 − 1 ⁄𝑟 0 0 0 0 1 ⁄𝑟 1⁄𝑟 0 1⁄𝑟 0 1 0 0 0 − 1 ⁄𝑟 0 0 − 𝑟 ⁄𝑟 𝑟 − 𝑟 ⁄𝑟 𝑟 − 1⁄𝑟 − 𝑟 ⁄𝑟 𝑟 0 − 𝑟 ⁄𝑟

Regulatory effects are Localized Example 1 - Example 2 - + + + - - - Nonzero responses are confined in limited regions in a network. 「上流が下流に影響する」という理解は間違い。

𝜒=𝑉−𝐸+𝐹 chemical, cycle reaction square Law of localization （限局則） Buffering structure （緩衝構造） 部分グラフ Γ = 𝑀, 𝐸 (𝑀 : 分子の集合, 𝐸 : 反応の集合) が次の条件を満たす とき、 Γ を緩衝構造と呼ぶ。 i) (𝑀 中の分子に依存する反応) ∈ 𝐸, ii) 𝜒 ≔ (分子数 𝑀 ) − (反応数 𝐸 ) + (サイクル数) = 0 Theorem 緩衝構造 Γ内の反応パラメータの変化は、Γ内の分子や反応のみに影響する。 #.chemical - #.reaction + #.cycle =3–4+1 =0 ・局所構造（トポロジー）だけから、反応パラメータの影響が及ぶ範囲がきまる。 Okada T. & Mochizuki A. Phys. Rev. Lett (2016) Okada T. & Mochizuki A. Phys. Rev. E (2017)

Buffering structures Example 1 Example 2 - #.metabolite - #.reaction + #.cycle =1–1+0 =0 #.metabolite - #.reaction + #.cycle =3–4+1 =0 #.metabolite - #.reaction + #.cycle =4–5+1 =0 metabolite with single output arrow is always “buffering structure”. ・緩衝構造とは、局所構造だけからきまる制御のモジュール（単位構造）

Example 3 Arabidopsis metabolism collaboration with Ali Ferjani (Gakugei Univ), Hirokazu Tsukaya (Univ Tokyo), Masami Y. Hirai (RIKEN) PPi UDP-Glucose fugu5 mutant • compensation between cellprolifera on↓ and cell-expansion↑ • Decrease in Sucrose production • Defect of H+-pyrophosphatase (H+PPase) Story: PPase break down ⇒ Sucrose↓ ⇒ Phenotypes Glucose-1-P Glucose-6-P Fructose-6-P PPi UDP Pi Sucrose-6-P Fructose-1,6-P2 Pi Sucrose ↓? Input Output Ferjani et al. (2018) Sci. Rep. 8, 14696.

Example 3 Arabidopsis metabolism Theoretical Analysis PPi UDP-Glucose fugu5 mutant • compensation between cellprolifera on↓ and cell-expansion↑ • Decrease in Sucrose production • Defect of H+-pyrophosphatase (H+PPase) Story: PPase break down ⇒ Sucrose↓ ⇒ Phenotypes Glucose-1-P Glucose-6-P Fructose-6-P PPi UDP Pi Sucrose-6-P Fructose-1,6-P2 Pi Sucrose Output Input ：No change ：Decrease ：Increase Observation cannot be explained by the network → examine network

緩衝構造 ネットワーク改変の効果 PPi UDP-Glucose Glucose-1-P Glucose-6-P Fructose-6-P PPi UDP Pi Sucrose-6-P Fructose-1,6-P2 0/－/＋ Pi Sucrose Output ：No change ：Decrease ：Increase Input #.metabolite - #.reaction + #.cycle = 6 – 11 + 5 =0 →：効果なし →：Sucrose減少（観測と合致） →：Sucrose増加（観測と逆） Ferjani et al. (2018) Sci. Rep. 8, 14696. 未知の化学反応を「必要条件」として予測

例4: 細胞周期システム →： G1/S複合体の量を変化させる反応パラメータ →： G2/M複合体の量を変化させる反応パラメータ Cyclin-Cdk複合体によるcheckpoint 制御 完全に分離 G2/M complex P-Wee1 Cdc2 G1/S complex Cdc2: Cdc13: Rum1 Cdc25 Cig2 Cdc13 Cdc2 Ste9:APC_a Cdc2 Cdc13_d Rum1 Cdc2: Cig2: Rum1 Cdc2 Cig2 G2/M complex Slp1:APC_a Cdc2:Cdc13 P-Cdc25 G1/S complex Ste9:APC_i Cdc13 Wee1 P-Cdc2:Cdc13 Slp1:APC_i Cdc2:Cig2 Cig2_d Cdc2 「一方が増えたらもう一方が減る」ということは無い

細胞周期制御の数値シミュレーション ダイナミクスを計算しながら、Cig2合成速度、Cdc13合成速度を変化 P-Wee1 Cdc2 Ste9:APC_i Slp1:APC_a Ste9:APC_a Cdc13 Wee1 P-Cdc2:Cdc13 Slp1:APC_i Cdc2 Cdc2:Cdc13 P-Cdc25 Cdc2: Cdc13: Rum1 Cdc25 Cdc13_d Cdc2: Cig2: Rum1 Cdc2 Cig2 increase cig2 synthesis Rum1 Cdc2:Cig2 Cdc2:Cig2 (G1/S) Cdc2:Cdc13 (G2/M) increase cdc13 synthesis Cig2_d Cdc2 G1/S複合体が大きく変化しているとき、G2/M複合体は全く変化なし。逆も同様。

例4: 細胞周期システム →： G1/S複合体の量を変化させる反応パラメータ →： G2/M複合体の量を変化させる反応パラメータ Cyclin-Cdk複合体によるcheckpoint 制御 完全に分離 G2/M complex P-Wee1 Cdc2 G1/S complex Cdc2: Cdc13: Rum1 Cdc25 Cig2 Cdc13 Cdc2 Ste9:APC_a Cdc2 Cdc13_d Rum1 Cdc2: Cig2: Rum1 Cdc2 Cig2 G2/M complex Slp1:APC_a Cdc2:Cdc13 P-Cdc25 G1/S complex Ste9:APC_i Cdc13 Wee1 P-Cdc2:Cdc13 Slp1:APC_i Cdc2:Cig2 Cig2_d Cdc2 〇： G1/S複合体を含む最大の緩衝構造 〇： G2/M複合体を含む最大の緩衝構造 緩衝構造により、チェックポイントの完全な独立制御が実現されている

代謝物濃度変化 MAL SUC FUM ICT 2-KG CIT OAA E4P X5P S7P R5P Ru5P 6PG 3PG CO2 AcCoA DHAP G3P F1,6P F6P PYR G6P PEP Glucose Glyoxylate Example 5：中心代謝系 反応酵素摂動 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 1617 18 19 20 21 22 2324 25 26 2728 29 30 31 32 3334 35 3637 38 39 40 4142 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

限局性と階層性 E. coli carbon metabolism 43 response Glucose PEP 1 perturbation 13 PYR G6P 6PG 14 2,3 F6P 4 21,22 F1,6P 5 DHAP E4P 19,20 15 Ru5P X5P 16 17, 18 R5P S7P 40 36 G3P 6 response G6P F6P 6PG Ru5P 2 3 4 13 14 15 16 36 43 7 3PG 8.9 PEP 31,32 42 PYR CO2 12 33 45 Lactate 38 10,11 OAA 37 AcCoA 23 Acetate 39 CIT Ethanol 44 G3P 7 R5P 40 F1,6P 5 DHAP 6 PEP PYR AcCoA OAA ICA MAL CO2 10 11 12 23 25 29 30 31 32 33 34 37 38 39 41 42 46 24 29,30 41 34 ICT MAL 35 Glyoxylate 28 25 X5P S7P E4P 17 18 19 20 21 22 Glucose 1 3PG 89 CIT 24 2-KG 26 SUC 27 FUM 28 Glyoxylate 35 Acetate 44 Lactate 45 Ethanol 46 2-KG FUM 27 SUC 26 ・Non-zeroの応答は限局する。 ・限局パターンは包含関係を示す。 Mochizuki A. & Fiedler B. (2015) J. Theor. Biol. 367, 189-202. Okada T. & Mochizuki A. (2016) Phys. Rev. Lett. 117, 048101

緩衝構造 ⇒ 応答パターン ・緩衝構造の存在 → 限局性 ・緩衝構造の入れ子 → 階層性 glycolysis Pentose phosphate pathway G6P F6P 6PG Ru5P 2 3 4 13 14 15 16 36 43 TCA cycle G3P 7 X5P S7P E4P 17 18 19 20 21 22 R5P 40 Glucose 1 F1,6P 5 3PG 89 DHAP 6 CIT 24 2-KG 26 PEP PYR AcCoA OAA ICA MAL CO2 10 11 12 23 25 29 30 31 32 33 34 37 38 39 41 42 SUC 27 FUM 28 Glyoxylate 35 Acetate 44 Lactate 45 E. coli中心代謝系は多重の防火扉を備えた頑健性を生むシステム Ethanol 46

まとめ 酵素パラメータの摂動 δkj に対する、化学反応システムの定性 的な応答 δxmは、反応ネットワークの形だけから決定できる。 (1) 摂動に対する応答は “興味深い”パターン、限局性と階層性を示す。 (2) 応答パターンは、「限局則」により、局所構造だけから理解できる。 (3) 測定結果と、理論予測との比較から、未知の反応の存在を予測できる。 「緩衝構造」は、恒常性や頑健性の起源だと考えられる。 さらに恒常性を保ったままでの複雑システムの制御も可能にし ている、と考えられる。 Mochizuki A. & Fiedler B. (2015) J. Theor. Biol. 367, 189-202. Okada T. & Mochizuki A. (2016) Phys. Rev. Lett. 117, 048101 Okada T. & Mochizuki A. (2017) Phys. Rev. E 96, 022322

Structural Theories 構造理論 Linkage Logic 制御ネットワーク ネットワーク構造 -> 重要な分子 Structural Sensitivity analysis 化学反応ネットワーク ネットワーク構造 -> 摂動に対する応答 Structural Bifurcation Analysis Network information Experiment ・Network analysis ・Measuring ・Perturbation Prediction without assuming details 化学反応ネットワーク ネットワーク構造 -> 分岐の定性的性質 生物学の問題意識からスタートし、 生物現象に限らず広く一般に適用可能な数理法則が得られた。

共同研究者 前田 一貴 （関西学院大学） 岡田 崇 （理研・iTHEMS） 蔡 志強（台湾国立精華大） Bernold Fiedler (Free Univ. Berlin) 山内 悠平（京都大・ウイルス再生研） 佐藤 ゆたか （京都大・理） 小林 健司 （京都大・理） 徳岡 三紀 （京都大・理） 永樂 元次 （京都大・ウイルス再生研） 遊佐 宏介（京都大・ウイルス再生研） 木立 尚孝（東京大・新領域） 石川 雅人（東京大・新領域）

理論生物学・数理生物学の教科書 理論生物学概論 望月敦史 著 共立出版 2021年 4月刊行 313頁 第1章：生命システム概論 第一部：時間的な変動の数理 第2章：合成と分解によるダイナミクス 第3章：遺伝子調節システムとそのダイナミクス 第4章：振動する生命システムI －体内時計と分節時計－ 第5章：振動する生命システムII －シアノバクテリア体内時計－ 第二部：ネットワークの数理 第6章：遺伝子調節システムと細胞の多様性 第7章：調節ネットワークの構造とダイナミクス 第8章：反応システムI －酵素による制御－ 第9章：反応システムII －振る舞いの多様性と分岐－ 第三部：時空間パターンの数理 第10章：神経細胞と興奮系の数理 第11章：反応拡散方程式とチューリングの拡散不安定性 第12章：生物で見られる様々な自己組織的周期パターン 第13章：自己組織的形態形成を実現する反応ネットワーク 第14章：細胞極性 第15章：細胞移動による形態形成 第16章：形態形成と生体分子ダイナミクスの結合 ・実際の生物現象に対する理論研究をトピックとして紹介し、 同時に数理的手法を学べる教科書。 ・理論に興味のある生命系の学生や、 生物学に興味のある理論系の学生が主な対象。 カバーイラスト：河本 宏 医生研所長 興味のある方は、手に取ってみてください。